魚肉中孔雀石綠殘留物的快速檢測表面增強拉曼光譜法

 

 

 

1、范圍

 

    本文件規(guī)定了采用表面增強拉曼光譜法快速測定魚肉中孔雀石綠殘留量的方法。

 

    本文件適用于魚肉中孔雀石綠的表面增強拉曼光譜快速篩查檢測。

 

 

2、規(guī)范性引用文件

 

    下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

 

    GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法

 

    GB/T20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法

 

 

3、術(shù)語和定義

 

3.1  表面增強劑surfaceenhancer

 

    能夠顯著增強吸附在其表面的分子的拉曼散射信號的納米結(jié)構(gòu)材料。

 

3.2  空白樣品blanksamples

 

    不含目標分析物，且組成及物理化學(xué)性質(zhì)與檢測樣品相同或充分相似的樣品。[來源：GB/T32467-2015，有修改]

 

 

4、方法原理

 

    試樣中的孔雀石綠殘留用乙腈提取，經(jīng)中性氧化鋁柱凈化后，用表面增強拉曼檢測儀測定?？兹甘G分子與表面增強劑混合后，目標分子吸附在表面增強納米粒子上從而增強其拉曼散射信號。表面增強拉曼檢測儀可通過自動識別特征峰對孔雀石綠進行定性檢測。

 

 

5、試劑與材料

 

    本方法所用水為GB/T6682規(guī)定的三級水。

 

5.1  試劑

 

5.1.1  乙腈（CH3CN）：分析純。

 

5.1.2  醋酸銨（CH3COONH4）：分析純。

 

5.1.3  無機鹽混凝劑：1mol/L氯化鈉水溶液，或其他相當(dāng)?shù)臒o機鹽溶液。

 

5.1.4  醋酸銨溶液（5mmol/L）：稱取0.385g醋酸銨，用水溶解，定容至1000mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

 

5.2  標準品

 

5.2.1  孔雀石綠標準品（CAS569-64-2）：純度≥99.0%。

 

 

5.3  標準溶液配制

 

5.3.1  孔雀石綠標準儲備溶液（50μg/mL）

 

    稱取5.0mg（精確至0.01mg）孔雀石綠標準品于100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，-18°C避光保存，有效期3個月。

 

5.3.2  孔雀石綠標準中間溶液（0.5μg/mL）

 

    吸取1.00mL孔雀石綠標準儲備溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，-18°C避光保存，有效期1個月。

 

5.3.3  孔雀石綠標準工作溶液（5μg/L）

 

    吸取1.00mL孔雀石綠標準中間溶液于100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

 

5.4  材料

 

5.4.1  表面增強劑：納米金-三聚氰胺海綿[1]，納米金，納米銀，或其他適用。

 

5.4.2  中性氧化鋁柱：80~120目，使用前用5mL乙腈活化。

 

5.4.3  有機0.2μm濾膜。

 

 

6、儀器和設(shè)備

 

6.1  表面增強拉曼光譜儀。

 

6.2  分析天平：感量0.01mg、0.01g。

 

6.3  離心機：轉(zhuǎn)速?4000r/min。

 

6.4  渦旋儀。

 

6.5  勻漿機。

 

6.6  超聲波清洗儀。

 

6.7  旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

 

6.8  KD濃縮瓶：25mL。

 

 

7、試樣的制備與保存

 

7.1  試樣的制備取適量新鮮或解凍的空白或供試組織的可食部分，絞碎，并使均質(zhì)。

 

    a)取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試樣；

 

    b)取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試樣；

 

7.2  試樣的保存-18°C以下保存。

 

 

8、步驟

 

8.1  提取

 

    稱取約5.0g(±0.01g)的試樣于50mL離心管中。加入11mL乙腈，超聲振蕩提取2min，渦旋30s，4000r/min離心5min，將上清液收集到25mL比色管中。殘渣再加乙腈11mL，重復(fù)提取一次，合并上清液。用乙腈定容至25mL，混勻備用。

 

8.2  凈化

 

    移取5.0mL上述提取液至活化的中性氧化鋁柱上，用KD濃縮瓶接收濾液。用4.0mL乙腈清洗中性氧化鋁柱并收集所有濾液。45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用乙腈將殘液定容1mL，超聲震蕩5min。加入1.0mL5mmol/L醋酸銨，超聲震蕩1min，經(jīng)0.2μm濾膜過濾。

 

8.3  測定

 

8.3.1  表面增強拉曼光譜儀參考條件

 

    激光能量≥100mW。

 

    數(shù)據(jù)采集時間≥2s。

 

    激光波長785nm±1nm。

 

    響應(yīng)范圍300cm-1~1800cm-1，或大于該響應(yīng)范圍。

 

8.3.2  樣品的測定

 

    將待測溶液、表面增強劑和無機鹽混凝劑按5:1:1的比例加入樣品池中，混合后進行拉曼檢測。曝光時間為30s。

 

8.3.3  空白試樣的測定

 

    稱取5.0g空白試樣，按照8.1和8.2步驟與樣品同法操作，拉曼光譜儀檢測。

 

8.3.4  加標試樣的測定

 

    稱取5.0g空白試樣于離心管中，加入5mL孔雀石綠標準工作溶液（5.3.3），按照8.1和8.2步驟與樣品同法操作，表面增強拉曼光譜儀檢測。

 

8.4  結(jié)果的判定

 

    檢測基于光譜435cm-1（±10cm-1）、1171cm-1（±10cm-1）、1615cm-1（±10cm-1）處的特征拉曼光譜，對樣品中孔雀石綠的含量進行判定。若同時存在上述特征峰且信噪比大于3，則檢測結(jié)果判定為陽性。陰性結(jié)果代表該樣品中不含有孔雀石綠或濃度低于5.0μg/kg。每批樣品應(yīng)同時進行空白實驗和加標樣品對照質(zhì)控實驗，且空白試樣測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標試樣測定結(jié)果應(yīng)為陽性。

 

8.5  復(fù)檢和確證

 

    本方法為初篩方法，若初檢結(jié)果為陽性，需要按照8.1和8.2步驟重新檢測；重復(fù)檢測結(jié)果仍為陽性，需要采用參比方法確證。參比標準為GB/T20361-2006《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法》。當(dāng)結(jié)果判定為陽性時，以參比標準方法確證結(jié)果為最終報告值。

 

 

9、方法的靈敏度和準確性驗證

 

9.1  靈敏度該方法中孔雀石綠殘留物的檢出限為5.0μg/kg。

 

9.2  準確性驗證在相同條件下進行至少三次連續(xù)的獨立測定，結(jié)果為一致。

 

 

10、檢測報告檢

 

    測報告應(yīng)包含以下數(shù)據(jù):

 

   ——鑒定樣品所需的所有信息；

 

    ——對本文件的引用；

 

    ——本文件中未指定或視為可選的任何操作細節(jié)，以及可能影響測試結(jié)果的任何事件的細節(jié)；

 

    ——測試日期；

 

    ——測試結(jié)果

 

附錄A（資料性）

孔雀石綠拉曼光譜示例

 

A.1孔雀石綠的拉曼光譜

 

圖A.1孔雀石綠（MG）和隱色孔雀石綠（LMG）的拉曼光譜

 

A.2含有不同濃度孔雀石綠的魚肉樣品的表面增強拉曼光譜

 

 

圖A.2含有不同濃度孔雀石綠的魚肉樣品的表面增強拉曼光譜圖（A：10μg/kg；B：5.0μg/kg；C：1.0μg/kg；D：空白）

 

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